NMY51 Chemically Competent Cell

酵母菌化學感受態細胞

溫馨提示

見我司（懋康生物）整理的酵母雙雜交（Yeast two-hybrid assay）產品專題。

產品關鍵詞：

Dualmembrane system 雙膜系統；Dualsystems Biotech；Y1HGold；pBT3-STE；pPR3-STE；NMY51；X-α-Gal；Aureobasidin A （AbA）；金擔子素；

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產品描述

雙膜系統（Dualmembrane system）是由Dualsystems Biotech公司開發的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的篩選技術，該技術利用分離的泛素系統直接檢測天然狀態下膜蛋白間的相互作用，是目前為止為一用來檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜交系統。

雙膜系統利用NMY51酵母菌，能直接轉化質粒進行蛋白突變驗證或篩庫實驗。轉化標志為TRP1，leu2-3。報告基因為HIS3，ADE2和LacZ。NMY51的選擇性生長篩選通過營養缺陷報告基因（HIS3，ADE2）進行，之后通過LacZ報告基因進行β-半乳糖分析的定量或半定量篩選，三個獨立的報告基因由不同的啟動子調控，有助于降低假陽性幾率。

雙膜系統的工作原理在于：泛素分子量很小，由76個氨基酸殘基組成。泛素作為降解信號分子，能夠連接另一個蛋白的N端，之后被泛素專一性蛋白酶（ubps）識別，導致與泛素相連蛋白被酶降解。泛素可人為分成兩個部分：N端（Nub）和C端（Cub）。首先，將泛素Nub的三位異亮氨酸突變成甘氨酸（Nubi突變為NuBG），通過這種方式Cub的親和力明顯降低，避免Cub和Nub自我結合或靠近的可能性。其次，Cub與合成的LEXA-VP16轉錄激活因子融合成融合蛋白Cub-lexa-vp16。正常情況下，NuBG不與Cub結合，ubps也不能識別分離的泛素，轉錄激活因子也不會被切下來。后，將待測蛋白分別與NuBG和Cub融合，形成bait融合蛋白（bait-cub-lexa-vp16）和prey融合蛋白（prey-NuBG）。如果bait和prey發生相互作用，促使NuBG和Cub的相互接近，從而被ubps識別，導致LEXA-VP16的解離，進入核內，進而激活報告基因的轉錄。該系統能使用四種Bait質粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標志是Leu。三種prey質粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標志是Trp。

本品為經特殊工藝制備的NMY51酵母菌化學感受態細胞，用pGADT7質粒檢測轉化效率＞10⁴cfu/μg DNA。且在-80℃能穩定保存三個月。

基因型

MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4

使用方法

1. Carrier DNA于使用前通過加熱處理使其變性為單鏈狀態，方法如下：95-100℃ 水浴或金屬浴3min，快速插入冰中，靜置3min。重復一次。

2. 取100 µl冰上融化的NMY51化學感受態細胞，依次加入預冷的目的質粒2-5 µg，單鏈Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500µl，用槍吹打幾次充分混勻，30℃水浴30 min（在15min時翻轉6-8次混勻）。

3. 之后將管子放42℃水浴15 min（在7.5min時翻轉6-8次混勻）。

4. 5000 rpm離心40s棄上清，用400 µl ddH₂O重懸沉淀，離心30s棄上清。

5. 用50 µl ddH₂O重懸，涂板，放入29℃培養48-96 h。

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— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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NMY51酵母菌化學感受態細胞

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