理，許多學者充分發揮創造性思維，對PCR技術進行研究和改進，使PCR技術得到了進上步地完善，并在此基礎上派生出了許多新的用途.

1、原位PCR技術

原位PCR就是在組織細胞里進行pcr反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術的優點，是細胞學科研與臨床診斷領域里的一項有較大潛力的新技術.

原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等.其基本方法為①固定組織或細胞:將組織細胞固定于預先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細胞內源性過氧化物酶.②蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K.③PCR擴增:在組織細胞片上，加PCR反應液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬板上，進行PCR循環擴增.有的基因擴增儀帶有專門用于原位PCR的裝置.④雜交:PCR擴增結束后，用標記的寡核苷酸探針進行原位雜交.⑤顯微鏡觀察結果.

原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內的位置，于分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉歸有重大的實用價值.其特異性和敏感性高于一般的PCR.

2、連接酶鏈反應

連接酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴增和檢測技術，主要用于點突變的研究及靶基因的擴增.

連接酶鏈反應是Backman1997年為檢出靶基因序列中的點突變而設計發明，并申報了.1988年Landegren也進行了該項研究.1988年Backman等又因分離熱穩定的連接酶，而申報，1991年Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶進行了LCR試驗.耐熱DNA連接酶可以在熱循環中保持活性，提高連接反應的特異性，排除了背景擴增和免除了不斷補充酶的繁瑣程序.

LCR的基本原理為利用DNA連接酶.特異地將雙鏈DN***段連接，經變性-退火-連接三步驟反復循環，從而使靶基因序列大量擴增.其程序為:在模DNA、DNA連接酶、寡核苷酸引物以及相應的反應條件下，首先加熱至一定溫度下(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65℃)，引物與之互補的模板DNA結合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列*互補，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應的三步驟(變性-退火-連接)就能反復進行，每次連接反應的產物又可在下一輪反應中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴增.若連接處的靶序列有點突變，引物不能與靶序列結合，缺口附近核苷酸的空間結構發生變化，連接反應不能進行，也就不能形成連接產物.

LCR的引物是兩對分別互補的引物，引物長度為20～26個，以保證引物與靶序列的特異性結合，LCR識別點突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結合，其次是耐熱連接酶的特異性.LCR連接反應溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識別單核苷酸錯配的特異性*.

LCR的擴增效率與PCR相當，用耐熱連接酶做LCR只用兩個溫度循環，94℃min變性和65℃復性并連接，循環30次左右.其產物的檢測也較方便靈敏.目前該方法主要用點突變的研究與檢測、微生物病原體的檢測及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態性及單堿基遺傳病的產物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等.

3、依賴核酸序列的擴增

依賴核酸序列的擴增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，又稱自主序列復制系統(self-sustainedsequence replication，3SR)或再生長序列復制技術.1990年Guali等首先報道了這一技術.NASBA主要用于RNA的擴增、檢測及測序.該反應有賴于AMV逆轉錄酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協作而完成.

NASBA反應體系中除含有上述三種酶外，還含有dNTP，NTP(核糖核苷)，

兩種特殊的引物和緩沖液.引物I3'末端與靶序列互補，5'端含T7RNA多聚酶的啟動子，這一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的堿基序列與cDNA的5'未端互補.

在NASBA反應時，首先引物Ⅰ與RNA模板復性(結合)，AMV逆轉錄酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一條單鏈的DNA;引物Ⅱ隨即與此cDNA的5'未端結合，逆轉錄酶在此DNA模板的指導下合成第二條DNA鏈.這樣形成的DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動子.該酶即以此DNA為模板，轉錄出與樣品RNA序列相同的RNA鏈，而且每條DNA模板在該酶的作用下可合成約100個拷貝的RNA.每條新的RNA又可作為逆錄酶的模板合成cDNA.如此反復進行，將獲得更多的RNA和cDNA.

其基本方法為:將引物，標本加入擴增反應液，65℃1min使RNA分子二級結構打開，降溫至37℃加入逆轉錄酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37℃反應1～1.5小時，其產物經瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶.NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環.整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高，其擴增效率高于PCR，特異性好.

4、轉錄依賴的擴增系統

轉錄依賴的擴增系統(Transcript-based amplification system，TAS)，是Kwen等人于1989年研究報道的，主要用于擴增RNA.

合成A、B引物，引物A的3'末端與待擴增RNA互補，其5'端有T7RNA多聚酶的啟動子信息.逆轉錄酶以A引物為起點合成cDNA;引物B與此cDNA3'端互補合成cDNA第二鏈.逆轉錄酶除具有逆轉錄活性外，還有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性.T7RNA多聚酶又以此雙鏈DNA為模板.轉錄出與待擴增RNA一樣的RNA，這些RNA又可作為下輪反應的模板.T7RNA多聚酶的催化效率很高，一個模板可轉錄10～103個RNA拷貝，因而反應液中待檢RNA的數量以10的指數方式擴增.

TAS的主要特點是擴增效率高，因為其RNA拷貝數呈10的指數方式增加，只需6個循環靶序列的拷貝數就能達到2×106.它的另一個特點是特異性高，由于TAS只能進行6次溫度循環，錯摻率低，加之用葡聚糖珠夾心雜交，因而特異性也高.雖然本法有較高的特異性和敏感性，但其循環過程復雜，需重復加入逆轉錄酶和T7RNA多聚酶，有待進一步研究.

5、Qβ復制酶反應

Kacian等于1972年報報Qβ復制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我復制功能，它能在常溫30min，將其天然模模MDV-1RNA擴增至109.1986年Chu等報道用生物標記的靶序列特異性探針，可與親和素聯接的MDV-1RNA雜交，經洗脫未被結合的MDV-1后，再加入Qβ復制酶，擴增復制MDV-1拷貝，然后用溴乙錠染色檢測或用同源性的第二探針雜交.

Qβ復制酶是一種RNA指導的RNA聚合酶，它有3個特點:①不需寡核苷酸引物的引導就可啟動RNA的合成.②能特異地識別RNA基因中由于分子內堿基配對而形成的*的RNA折疊結構.③在Qβ復制酶的天然模板MDV-1RNA的非折疊結構區插入一短的核酸序列不影響該酶的復制.因而，如在此區插入核酸探針，則其序列照樣可能被Qβ復制酶擴增.

1988年Lizardi等，將靶基因序列插進MDV-1質粒里，用T7RNA聚合酶催化轉錄出MDV-1RNA探針，這種RNA探針可與靶序列雜交，然后洗去非雜交的探針，加入Qβ復制酶來擴增探針，被擴增的探針又可作為模板進行擴增，并呈指數遞增.其產物按上述兩種方法進行檢測.現在該技術又發展了夾心雜交法，分子開關和靶依賴的復制等技術.

6、標記PCR和彩色PCR

標記PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利同位素或熒光素對PCR引物的5'端進行標記，用來檢測靶基因是否存在.彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一種.它用不同顏色的熒光染料;標記引物的5'端，因而擴增后的靶基因序列分別帶有引物5'的染料，通過電泳或離心沉淀，肉眼就可根據不同熒光的顏色判定靶序列是否存在及其擴增狀況，此法可用來檢測基因的突變，染色體重排或轉位，基因缺失及微生物的型別鑒定等.

7、反向PCR

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DN***段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.

8、不對稱PCR

不對稱PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(SSDNA).這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應的zui初10～15個循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA.不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的量，需多次摸索優化兩條引物的比例.還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴增，制備雙鍵DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進行第二次PCR，制備ssDNA.不對稱PCR制備的ssDNA，主要用于核酸序列測定.

9、重組PCR

使兩個不相鄰的DN***段重組在一起的PCR稱為重組PCR(recombinant PCR).Mullis等于1986年報道了由PCR擴增的兩個DN***段通過重組合后再經延伸而制備出新的DNA分子.其基本原理為將突變堿基，插入或缺失片段，或一種物質的幾個基因片段均設計在引物中，先分段對模板擴增，除去多余的引物后，將產物混合，再用一對引物對其進行PCR擴增.其產物將是一重組合的DNA.重組PCR主要用于位點專一堿基置換，DN***段的插入或缺失DN***段的連接(如基因工程抗體).

10、多重PCR

一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定.多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同.

11、多重PCR的用途主要有兩方面:

1.多種病原微生物的同時檢測或鑒定，它是在同一PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增.可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染，，可系統組合的有:①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者體內，有時存在多種肝炎病毒重疊感染，有時是甲乙丙型肝炎病毒重疊;有時可能是甲乙型肝炎病毒重疊;有時是乙丙型肝炎病毒重疊.②腸道致病性細菌的檢測，如傷寒，痢疾和霍亂，有時具有較相同的腸道癥狀，有時痢疾霍亂同存一病人并同時發病.③性病的檢測，如梅毒，淋病及艾滋病的診斷.④戰傷細菌及生物戰劑細菌的檢測，如破傷風桿菌，產氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，鼠疫桿菌等偵檢.⑤需特殊培養的無芽胞厭氧菌，如脆弱類桿菌、艱難桿菌的鑒定等.

2，病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定:某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個好發部位，多重PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等可系統應用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳頭瘤病毒的分型;單純皰疹病毒的分型;杜氏肌營養不良癥的分型及癌基因的檢測等.

多重PCR的特點有:①性，在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體.②系統性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時偵檢.③經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息.

12、免疫-PCR

免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統.它利用抗原-抗體反應的特異性和PCR擴增反應的*靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測.

免疫-PCR試驗的主要步驟有三個:①抗原-抗體反應，②與嵌合連接分子結合，③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質粒DNA).該技術的關鍵環節是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質粒DNA結合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標記物不是酶而是質粒DNA，在操作反應中形成抗原抗體-連接分子-DNA復合物，通過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原.

免疫PCR優點為:①特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性反應的基礎上.②敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢測.③操作簡便，PCR擴增質粒DNA比擴增靶基因容易得多，一般實驗室均能進行.