實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA，RNA質(zhì)
量的高低常常影響cDNA文庫、RT-PCR、Northern Blot、點(diǎn)雜交及5’ RAGE等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。
實(shí)驗(yàn)原理：Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍和酚等物質(zhì)，能迅速破
碎細(xì)胞和溶解細(xì)胞中的其它成分，抑制細(xì)胞釋放出核酸酶，維持細(xì)胞中RNA的穩(wěn)定，加入氯仿離心后，RNA進(jìn)入水相，再用異丙醇沉淀水相中的RNA，即可達(dá)到提取總RNA的目的。
實(shí)驗(yàn)要求： 1.了解Trizol法分離總RNA的原理。
2.掌握從培養(yǎng)細(xì)胞中提取、分離總RNA的方法。
3.掌握RNA電泳檢測(cè)膠的制備、電泳、染色及分析
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 物品的準(zhǔn)備：
盡可能使用無菌、一次性塑料制品，已標(biāo)明RNase-Free且未開封過的塑料制品，不必再進(jìn)行其他處理，對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品，應(yīng)按下列方法進(jìn)行處理：
在一玻璃燒杯中注入含終濃度為0.1%DEPC的去離子水，將要處理的塑料制品浸泡其中12小時(shí)以上，棄DEPC水溶液，適溫烘烤干燥已處理過的塑料制品，再經(jīng)103.4kPa，121℃高壓滅菌15分鐘， 70-80℃烘烤干燥即可使用。氯仿、異丙醇、75%乙醇(用DEPC-treated Water)、RNase-free Water
2. 培養(yǎng)細(xì)胞總RNA的提取及分離：
1) 細(xì)胞的裂解 (起始量：1 x 106 )
方法 a：( 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 ) 800 g 離心 10 分鐘后*棄上清。加入 1 mlTrizol Reagent，立即用移液器抽打 5 次。
方法 b：( 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞 ) 將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液*棄干凈。將 1 mlTrizol Reagent 直接加在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞上。將細(xì)胞并Trizol 一起移入eppendorf 離心管中。
2) 室溫靜置 5 分鐘。再加入 0.25 ml 氯仿，用力顛倒離心管以混勻。靜置 5 分鐘后，以12000g的離心速度離心 10 分鐘。
3) 小心將上層水相移至另一離心管中，再加入0.7倍體積的異丙醇，振蕩混勻。室溫放置 10 分鐘。
4) 以12000g的離心速度離心 10 分鐘。小心地棄上清。
5) 在離心管中加入 1ml 70% 乙醇(DEPC水新鮮配制)，顛倒混勻，離心 5 分鐘。小心地棄上清。
6) 室溫靜置 5-15 分鐘使 RNA 沉淀恰好干燥。加入50 ul RNase free H2O和 1-2 ul RNA 保護(hù)劑溶解 RNA。
混勻后取 1--5 ul 電泳，檢測(cè) RNA的完整性 (使用 DNA 電泳方式即可，但要使用進(jìn)口分子生物學(xué)級(jí)別的Agarose。完整的 RNA 具備 28 S 條帶的亮度> 18 S 條帶的亮度之特點(diǎn));取 1-5ul 測(cè)定 A260 值計(jì)算總 RNA 的量。剩下的 RNA 保存于冰上 (如果馬上進(jìn)行 mRNA 抽提)，或者-70 oC (如果不馬上進(jìn)行 mRNA 抽提)。如果電泳證明 RNA 是完整的，方可進(jìn)行下面的 mRNA 純化，否則重新開始抽提總 RNA。如果總 RNA 的 量 太低 (假定 mRNA 占總 RNA 量的1%)，使用更多的樣品再抽提，以獲得足夠的總RNA。
3. 從總RNA中分離mRNA
利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特點(diǎn)，合成一段Oligo(dT)引物，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，可將mRNA從總RNA中分離出來。
注意事項(xiàng)：
RNase酶是導(dǎo)致RNA降解的zui主要的原因，它廣泛存在于人的皮膚上，而RNase酶非常穩(wěn)定，用常規(guī)的高壓蒸汽滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase酶*失活，因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)一定注意戴手套，同時(shí)所有的實(shí)驗(yàn)用具需經(jīng)0.1%的DEPC水處理12小時(shí)以上，以去除RNase酶。
Trizol reagent、氯仿、DEPC水是劇毒物質(zhì)，要注意防護(hù)。在吸取濃DEPC水，或用DEPC水處理塑料制品時(shí)，要注意在通風(fēng)柜中進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)中常見問題及原因分析：
RNA的產(chǎn)量低
可能的原因：
1) RNA溶解不*;
2) 離心速度過大(大于12000g);
3) 加入Trizol reagent后，勻質(zhì)化不*，應(yīng)在室溫下放置一 段時(shí)間后，再加入氯仿。
RNA降解
可能的原因：
1) 加入Trizol reagent以前，細(xì)胞處理步驟過多，改正：棄盡上清，直接加入Trizol reagent，室溫放置即可;
2) 不正確的儲(chǔ)存方法：應(yīng)存于-70°C，而不是-20°C。
A260/280少于1.65
可能的原因：
1) 加入Trizol reagent量不夠，而使細(xì)胞勻質(zhì)化不*;
溶解RNA的溶液偏酸。
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