滬震生物教您養平滑肌細胞及內皮細胞
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血管內皮細胞不僅參與調節血管通透性和凝血過程，在免疫調節，移植排斥，腫瘤轉移，炎癥等許多過程中也具有重要作用。內皮細胞培養是體外研究內皮細胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了內皮細胞分離及體外培養的方法。人臍帶靜脈是人血管內皮細胞zui易獲取的來源，在人內皮細胞的研究中被普遍采用。
㈠ 原理在體外，內皮細胞在內皮細胞生長因子存在的條件下可迅速增殖，并可傳代，可作為內皮細胞增殖，細胞因子分泌、表型等研究的模型。
㈡ 方法
1. 臍帶內皮細胞的分離
試劑與器材
⑴ 膠原酶(Sigma)：I型((C-0130),用無血清RPMI 1640配成0.1％(W/V),分裝、-20℃保存。
⑵ Cord Buffor：
1.　標本采集　在無菌條件下于健康產婦分娩后立即取新生兒臍帶， 擠出臍帶血管中的血液，放入裝有含青*的PBS液瓶中，2h之內行臍靜脈內皮細胞培養。
雙抗：*100u/ml; *100μl/ml
PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸餾水中加入上述質量物質，用鹽酸調節溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。

2.　原代血管內皮細胞的獲取與培養　按Jaffe等人〔1〕的方法加以改進。在無菌條件下取新生兒臍帶，剪去鉗痕和凝阻塞部分，找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結扎固定，經膠管接注射器，用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內的殘血除凈后，用37℃ PBS，沖洗兩次，將另一端用鐵夾夾閉，向臍靜脈內灌注0.25%*8～10ml，夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期間經常翻動臍帶使酶溶液在血管內流動以促使內皮細胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁，將含有內皮細胞的*注入50ml錐形離心管中，加入小牛血清2ml終止酶反應。再以30ml PBS沖洗管腔，流出液一并入離心管，1000r/min離心10min，棄上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)？]培養液，充分混合制成細胞懸液。取0.1ml細胞懸液在*計數。zui后調細胞數，以1×105/ml接種至24孔培養板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃靜止培養24h更換培養液，以除去未貼壁的細胞。以后每隔2d換液1次，以維持細胞的營養和內環境的穩定。
*溶液（100ml）配制：1）將D-Hanks（橙紅色）液高壓消毒滅菌，用NaHCO3液調節pH至7.2左右。 2）稱取*粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調成糊狀，然后再補足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱內過夜，并不時攪拌振蕩。 3）次日先用濾紙粗慮，再過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱或－20℃保存備用，常用濃度為0.25％或0.125％；*溶液（深紅色）偏酸，使用前用NaHCO3調pH至7.2左右。
D－Hanks液配制：
KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L,
Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚紅 0.02 g/L

3．傳代內皮細胞的培養　原代內皮細胞融合后用培養液沖洗兩次，然后用0.25%*加入到內皮細胞中，每孔0.3ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養液，吸管吹打，制成細胞懸液，計數后按105個細胞/ml，繼續培養。

4．血管內皮細胞的鑒定 　1）倒置顯微鏡觀察細胞的形態特點。2）VWF相關抗原免疫熒光檢查：在24孔塑料培養板孔內放置無菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm，每孔中種植1ml含有105個細胞的原代或傳代內皮細胞懸液。待內皮細胞生長至近融合狀態時，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，投入冷丙酮中(-18～-20℃)，細胞面向上，作用7min，用PBS沖洗3次，每次1min，而后進行間接免疫熒光檢查，*抗體為鼠抗人VWF單克隆抗體(蘇州醫學院血栓室提供)，1∶20倍稀釋，加入50μl于蓋玻片上，放入濕盒內4℃過夜。同時不加一抗做陰性對照。用PBS沖洗3次后，加入異硫氫酸標記的二抗50μl(異硫氰酸標記羊抗鼠IgG，北京)，放入37℃2h后，用PBS洗滌3次。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。 血管內皮細胞鑒定結果：　VWF相關抗原間接免疫熒光檢查，原代及傳代培養的內皮細胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個細胞輪廓清楚。作為對照的內皮細胞片子中，偶見綠色斑點散發熒光，未見細胞輪廓。

5．內皮細胞體外生長情況　 用*消化的人臍靜脈內皮細胞，接種在24孔塑料培養板各孔內4h后，大部分細胞貼壁。早期細胞呈小多角、球形、呈團狀，少數細胞伸展，48～72h生長zui快，逐漸生長成梭形，有些細胞排列呈魚貫狀相連，間有旋禍狀排列。核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見，1～2核仁，胞漿豐富，內含小顆粒。于3～4d后融合，7～10d胞體呈多角形，相互嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。
用dmem配0.2%的1型膠原酶[用20的血清的dmem配可能更好，有類似文獻}，分裝于*小并，每并2-3ml。1只免的胸主動脈置于1并消化液中消化，消化約10幾個小時{消化程度的把握要體會}，離心后，接種{若見細胞量大，成功把握大}，靜置3天{沒必要看，看多了無益}，8天可傳代。