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WB實(shí)驗(yàn)代測，Western Blot技術(shù)服務(wù)，免疫印跡代測
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產(chǎn)品簡介
產(chǎn)品介紹
本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)，不得用于醫(yī)療或食用
| 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)zui初用于研究DNA 結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
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2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準(zhǔn)確性！ 2 、蛋白定量 常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白 3 、電泳分離蛋白質(zhì) 根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件：
根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：
去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS 6 、一抗孵育 一抗的選擇成功與否，是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn)： 選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗(yàn)證） 選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說明書有驗(yàn)證） 選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體 一抗的保存和使用： 根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。 抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周 根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。 孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個(gè)小時(shí)），根據(jù)抗體親和力不同孵育時(shí)間有所區(qū)別 內(nèi)參的選擇和使用：WB 過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)！ WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)：
7 、二抗孵育 根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí) 8 、底物孵育 選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量 9 、結(jié)果分析和檢測 凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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