做過原代細胞的人都知道，實驗看似容易，但真想把結(jié)果做漂亮，還是需要花上很長一段時間去積累和摸索經(jīng)驗。很多人剛開始啥也不懂，一味按照網(wǎng)上操作流程來做，但做的結(jié)果往往并不是十分理想，終結(jié)果未能達到預(yù)期的效果。就來給大家分享下原代細胞實驗中會會遇到的問題以及經(jīng)驗總結(jié)。

一、石蠟切片和冰凍切片的區(qū)別是什么？

 1.冰凍切片常用于手術(shù)中的快速病理診斷，優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做原代細胞時不需抗原修復(fù)這一步。缺點是細胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。

2.石蠟切片廣泛應(yīng)用于常規(guī)制片，優(yōu)點是可以保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫長久保存。缺點是步驟繁多，需要抗原修復(fù)。

3.抗體應(yīng)用中能做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因為石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是能做石蠟切片的，可同時做冰凍切片。

二、如何才能充分脫蠟？

 1.蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須脫蠟，原代細胞目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短；

2.脫蠟的時間要靈活調(diào)整。如果在夏天，室溫較高，則脫蠟時間不需很多，3-5 min 就已足夠。如果在冬天，室溫較低，則脫蠟時間需要延長，10-20 min 或更長。

3.當天切的切片，烤 2 小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫 10-20 min，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果會更好。

三、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？

1.一般 3% 過氧化氫滅活時間短點，可以避光 10 min；而 0.3% 過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般 10-30 min。

2.用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS 好，能更好保護抗原和固定組織，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片。

3.現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4oC 避光保存。

四、蘇木素復(fù)染時間如何把握？

1.蘇木素復(fù)染時間要根據(jù)溫度，試劑新舊和目標物的定位變動，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。對于細胞核定位的指標，減少蘇木素染色時間。

2.鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（動作一定要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。

3.如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。

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