細胞壁不溶性酸性轉化酶（B-AI）檢測試劑盒

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

蔗糖轉化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關鍵酶之一。根據最適 pH，Ivr 分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）兩種類型。

AI 的最適 pH 為 3～5。AI 分為可溶性 AI(S-AI)和細胞壁不溶性 AI（B-AI）兩種類型。B-AI 存在于細胞間隙并結合在細胞壁上，主要參與韌皮部質外體卸載時蔗糖的分解，以維持庫源之間蔗糖的濃度。

測定原理：

B-AI 催化蔗糖降解產生還原糖，進一步與 3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，在 510nm 有特征光吸收，在一定范圍內 510nm 光吸收增加速率與B-AI 活性成正比。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液 1：液體 100mL×1 瓶，4℃保存; 提取液 2：液體 100mL×1 瓶，4℃保存; 試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存;

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 10mL 試劑一充分溶解備用；用不完的試劑 4℃ 保存;

試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃避光保存；

粗酶液提?。?/span>

按照組織質量（g）：提取液 1 體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液 1），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心 10min，棄上清，沉淀中加入 1mL 蒸餾水，充分震蕩混勻，12000g 4℃離心 10min，棄上清，沉淀中加入 1mL 提取液 2 充分混勻，4℃浸提過夜， 12000g 4℃離心 20min，取上清置冰上待測。

細胞壁不溶性酸性轉化酶（B-AI）檢測試劑盒測定步驟和加樣表：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 510nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定，（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

混勻， 37℃準確水浴 30min 后，95℃水浴 10min（蓋緊，以防水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

混勻，95℃水浴 10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻，取 200μ  L 至微量石英比色皿或 96 孔板中， 510nm 處記錄各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式中乘以相應稀釋倍數)，Δ A=A 測定-A 對照。每個測定管設一個對照管。

細胞壁不溶性酸性轉化酶（B-AI）檢測試劑盒活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001；x 為標準品濃度（μ  g/mL），y 為吸光值。

（1） 按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每 mg 蛋白每分鐘產生 1μ g 還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI 活性（μ g /min/mg prot）＝[(Δ A +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(Δ A

+0.001) ÷Cpr

（2） 按鮮重計算：

單位的定義：37℃每g 組織每分鐘產生 1μ g 還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI 活性（μ g /min /g 鮮重）＝[(Δ A +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(Δ A

+0.001) ÷W

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，30min； Cpr： 樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001；x 為標準品濃度（μ  g/mL），y 為吸光值。

（1） 按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每 mg 蛋白每分鐘產生 1μ g 還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI 活性（μ g /min /mg prot）＝[(Δ A +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(Δ A

+0.001) ÷Cpr

（2） 按鮮重計算：

細胞壁不溶性酸性轉化酶（B-AI）檢測試劑盒單位的定義：37℃每g 組織每分鐘產生 1μ g 還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI 活性（μ g /min /g 鮮重）＝[(Δ A +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2)=41.6×(Δ A

+0.001) ÷W

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，30min； Cpr： 樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。