硝酸還原酶（NR）檢測試劑盒正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

NR（ EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態氮轉化為氨態氮的關鍵酶，也是誘導酶，對作物的產量和品質有影響。

測定原理：

NR 催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；產生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物；生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測定。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

硝酸還原酶（NR）檢測試劑盒試劑的組成和配制：

誘導劑儲備液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，-20℃保存。試劑二：液體 5mL×1 瓶，-20℃保存。

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存（如出現結晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑五：標準儲備液 1mL，-20℃保存。

誘導劑應用液的配制：用時將誘導劑儲備液稀釋 10 倍，即取 10mL 誘導劑儲備液加 90mL 蒸餾水，充分混勻。

0.1umol/mL 的標準液的配制：用時將試劑五稀釋 100 倍，即取 0.1ml 試劑五加 9.9mL 蒸餾水，充分混勻。

樣品測定的前處理

組織的前處理：

（1） 取適量誘導劑于燒杯中，將新鮮標本洗凈，濾紙吸干，放入誘導劑應用液中（淹沒即可），浸泡 2h，取出樣本，濾紙吸干后，-20℃冷凍 30min，取出樣本，濾紙吸干。（一般不要誘導處理，預測定結果沒有活性則需要誘導處理）

（2） 按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

細菌或培養細胞的前處理：

先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

硝酸還原酶（NR）檢測試劑盒測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

混勻后，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）反應 30min

混勻，室溫顯色 20min，540nm 處比色注意：標準管和空白管只需測一次，每個測定管設一個對照管。

NR 活性計算：

（1） 按樣本鮮重計算：

單位定義：每小時每g 鮮重樣品中催化產生 1μ mol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。

NR（μ mol/h/g 鮮重）= (C 標準管×V1)×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）

÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）÷W

（2） 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每小時每 mg 組織蛋白催化產生 1μ mol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。

NR（μ mol/h/mg prot）=(C 標準管×V1)×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）

÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）÷Cpr

硝酸還原酶（NR）檢測試劑盒C 標準管：標準管濃度，0.1μ mol/mL；V1：加入樣本體積：0.02mL；V2：加入提取液體積， 1mL；T：反應時間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。