谷氨酸脫氫酶（GDH）檢測試劑盒紫外分光光度法活性檢測說明書

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

GDH（EC 1.4.1.2）廣泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同參與谷氨酸的合成，在氨同化和轉化成有機氮化合物的代謝中起重要作用。

測定原理：

GDH催化NH₄⁺ 、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通過測定340nm吸光度的下降速率，計算GDH活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 支，4℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存。

谷氨酸脫氫酶（GDH）檢測試劑盒粗酶液提取：

1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前將試劑二、三、四轉移到試劑一中混合溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現配現用；

（2）取 0.05mL樣本和1mL工作液于1mL比色皿中，混勻，加工作液的同時開始計時，在340 nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1和5分20秒時的吸光度A2，計算 ΔA=A1-A2。

GDH 活性計算：

1、血清（漿）中 GDH 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=675×ΔA

谷氨酸脫氫酶（GDH）檢測試劑盒2、組織、細菌或細胞中 GDH 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=675×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V 樣總) ÷T

=675×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V樣總×500) ÷T

=1.35×ΔA

谷氨酸脫氫酶（GDH）檢測試劑盒V 反總：反應體系總體積，1.05×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，50 0 萬