抗壞血酸過氧化物酶（APX）檢測試劑盒微量法說明書
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關鍵酶之一。APX 具有多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質、線粒體、過氧化物和乙醛酸體，以及過氧化體和類囊體膜上。APX 催化 H 2 O 2 氧化 AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影響到AsA 的含量，APX 與 AsA 具有一定的負相關性。
測定原理：
APX 催化H2O2氧化AsA，通過測定AsA氧化速率，來計算得APX 活性。
自備實驗用品及儀器：
低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×2 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 3 mL 蒸餾水充分溶解。試劑三：液體×1 支，4℃保存。
抗壞血酸過氧化物酶（APX）檢測試劑盒粗酶液提取：
按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。13000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測。
測定：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長到290nm，用蒸餾水調零。
2. 試劑一在 25℃中預熱 30min。
3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μ L 上清液、140μ L 預熱的試劑一 20μ L 試劑二和20μ  L 試劑三，迅速混勻后在 290nm 測定 10s 和 130s 光吸收 A1 和 A2，△A=A1-A2。
APX 活性計算：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1μ mol AsA 為 1 個酶活單位。APX(μ mol/min/mg prot) = △A÷(ε ×d）×V 反總×106÷(Cpr×V 樣)÷T
=1.79×△A÷ Cpr
（2）按樣本質量計算
活性單位定義：每 g 組織每分鐘氧化 1μ mol AsA 為 1 個酶活單位。APX(μ mol/min/g ) = △A÷(ε  ×d）×V 反總×106÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
=1.79×△A ÷W
ε ：AsA 在 290nm 處摩爾吸光系數為 2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V 反總：反應體系總體積（L），200μ L=2×10-4 L；106：1mol=1×106μ mol；Cpr：上清液蛋白質

濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量； V 樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μ L=0.02mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T： 催化反應時間（min），2min。
抗壞血酸過氧化物酶（APX）檢測試劑盒b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1μ mol AsA 為 1 個酶活單位。APX(μ mol/min/mg prot) = △A÷(ε ×d）×V 反總×106÷(Cpr×V 樣)÷T
=3.58×△A÷ Cpr
（2）按樣本質量計算
活性單位定義：每 g 組織每分鐘氧化 1μ mol AsA 為 1 個酶活單位。APX(μ mol/min/g ) = △A÷(ε  ×d）×V 反總×106÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
=3.58×△A ÷W
ε ：AsA 在 290nm 處摩爾吸光系數為 2.8×10 3 L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm； V反總：反應體系總體積（L），200μ L=2×10 -4 L；106：1mol=1×106μ mol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V 樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μ L=0.02mL；V 樣總：提取液體積，1 mL； T：催化反應時間（min），2min。
抗壞血酸過氧化物酶（APX）檢測試劑盒注意事項：
配制好的試劑二 4℃保存，并且 3 天內使用完