脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）檢測試劑盒

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：
DHAR存在于細胞質、線粒體和葉綠體中。DHAR催化GSH還原DHA生成AsA和GSSG，調控細胞AsA/DHA比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環的關鍵酶。提高植物體內的DHAR活性，可提高植物食品中AsA含量，進而提高植物食品的營養品質。
測定原理：
DHAR催化GSH還原DHA生成AsA，通過測定DHA減少速率，計算DHAR活性。
自備實驗用品及儀器：
研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可調式移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。 臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。 臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。
脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）檢測試劑盒粗酶液提取：
1. 按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500 萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；8000g 4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測。
3. 血清等液體：直接測定。
DHAR 測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到265nm，蒸餾水調零。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱30min。
3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μ L上清液、20μ L試劑三、20μ L試劑四和140μ L 試劑二，迅速混勻后于265nm比色，記錄30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。
DHAR 活性計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε ÷d×V 反總×109÷(Cpr×V 樣)÷T
= 92×△A ÷Cpr

按樣本質量計算
活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/g) = △A÷ε ÷d×V 反總×109÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 92×△A ÷W
(3). 按細胞數量計算
活性單位定義：25℃中每104個細胞每分鐘還原生成1nmol AsA為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/104cell) = △A÷ε  ÷d×V 反總×109÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 92×△A ÷細胞數量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε ÷d×V 反總×109÷V 樣÷T
= 92×△A
ε ：AsA在265nm處摩爾吸光系數為5.42×104L/mol/cm；106：摩爾分子換算成微摩爾分子；d： 比色杯光徑，1cm；V 反總：反應體系總體積，0.2mL=2×10-4 L；V 樣：反應體系中加入上清液體積，20μ L =0.02mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W ： 樣品質量；T：反應時間，2 min。
脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）檢測試劑盒b. 使用96孔板測定的計算公式如下(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε ÷d×V 反總×109÷(Cpr×V 樣)÷T
= 184×△A÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/g) = △A÷ε ÷d×V 反總×109÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 184×△A ÷W
(3). 按細胞數量計算
活性單位定義：25℃中每104個細胞每分鐘還原生成1nmol AsA為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/104cell) = △A÷ε  ÷d×V 反總×109÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 184×△A ÷細胞數量
(4). 按液體體積計算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA為1個酶活單位。DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε ÷d×V 反總×109÷V 樣÷T
= 184×△A
脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）檢測試劑盒ε ：AsA在265nm處摩爾吸光系數為 5.42×104L/mol/cm；106：摩爾分子換算