ELISA是以免疫學反應為基礎,將抗原、抗體體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。
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Pig Lipopolysaccharide Binding Protein (LBP) ELISA
固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器,不參與化學反應。可作ELISA中載體的材料很多,zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能,抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性,加之它的價格低廉,所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料,可制成各種形式。 ELISA載體的形狀主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板zui為常用,于EILSA的產品稱為ELISA板,上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測,有制成8聯孔條或12聯孔條的,放入座架后,大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測,并可在特制的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測,包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟,對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經射線照射后,其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加,應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多,但用于間接法測抗體時空白值較大。 良好的ELISA板應該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各種產品的質量差異很大,因此,每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體,保溫后洗滌,加底物顯色,終止酶反應后,分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件,使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個讀數與全部讀數的均數之差,應小于10%。 與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯的特點為質軟板薄,可剪割,價廉,但光潔度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。 為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣,可應用如下的試驗:用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本,將它們進行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定,然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別zui大,這種載體就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體。 在ELISA中,用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2,小珠均為1000mm2,將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者,球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于反應狀態,因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌*,使用特殊的洗滌器,使小珠在洗滌過程中滾動淋洗,其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大,小珠的均一性較差。 小試管作為固相載體也有較大的吸附表面,而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為00-200ul,而小試管可根據需要加大反應體積,標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯,zui后直接放入分光光度計中比色。 也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優點是表面積*,反應在懸液中進行,其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應后用磁鐵的吸引進行分離,洗滌方便,試劑盒一般均配以特殊儀器。
樣本處理及要求:1. 血清:室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分) 。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。2. 血漿:應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合 10-20 分鐘后,離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分) 。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。3. 尿液:用無菌管收集,離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分) 。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。24. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分) 。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用 PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分) 。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的 PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS(PH7.4) ,用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分) 。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.7. 不能檢測含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
人POTE錨蛋白域家族成員G(POTEG)測定盒Human POTE Ankyrin Domain Family, Member G (POTEG) ELISA
人肺部激活調節趨化因子(PARC)測定盒Human Pulmonary Activation Regulated Chemokine (PARC) ELISA
豬腫瘤壞死因子α(TNFα)檢測盒Pig Tumor Necrosis Factor Alpha (TNFa) ELISA
人Toll樣受體9(TLR9)測定盒Human Toll Like Receptor 9 (TLR9) ELISA
人生長激素2(GH2)測定盒Human Growth Hormone 2 (GH2) ELISA
豬多配體蛋白聚糖1(SDC1)檢測盒Pig Syndecan 1 (SDC1) ELISA
豬成纖維細胞生長因子15(FGF15)檢測盒Pig Fibroblast Growth Factor 15 (FGF15) ELISA
人Epigen蛋白(EPG)測定盒Human EPig en (EPG) ELISA
人N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)測定盒Human N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase (NAGase) ELISA
豬輸出蛋白1(XPO1)檢測盒Pig Exportin 1 (XPO1) ELISA
豬一氧化氮合酶相互作用蛋白(NOSIP)檢測盒Pig Nitric Oxide Synthase Interacting Protein (NOSIP) ELISA
豬骨髓基質細胞抗原1(BST1)檢測盒Pig Bone Marrow Stromal Cell Antigen 1 (BST1) ELISA