中文名稱：CFSE/PI雙染細胞毒性檢測試劑盒
英文名稱：
產品規格：500T
產品貨號：BJ-01X6513
CFSE/PI 雙染細胞毒性檢測試劑盒是利用細胞熒光染料CFSE(CFDA-SE)和PI對細胞進行染色，利用CFSE標記靶細胞，PI標記死的靶細胞來區分不同的細胞，活的靶細胞成綠色，死的靶細胞成紅色和綠色，從而檢測細胞毒性作用。根據不同的實驗方案設計，可以用來檢測化合物的細胞毒性作用。也可以用來檢測殺傷性T 細胞或NK 細胞介導的細胞毒作用。 CFDA-SE 是一種可對活細胞進行熒光標記的新型染料，可以標記活體細胞。CFDASE是一種帶有琥珀酰亞胺(NHS)的熒光染料，可以結合細胞內的蛋白質。CFDASE在結構上將酚羥基部位改造成AM體，所以自身不發熒光，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細胞膜，進入細胞內的CFDASE的AM 部位能被細胞內酯酶水解生成CFSE，通過共價結合賴側鏈的氨基而摻入細胞內和細胞表面的蛋白，且結合后發出強的綠色熒光。CFSE的琥珀酰亞胺(NHS)和細胞內蛋白質的氨基部位結合，固定在細胞內，不會漏出細胞外。CFSE進入細胞后定位于細胞膜、細胞質和細胞核，在細胞核的熒光強。 CFSE毒性小，不影響細胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患。可以更快速，更準確和更安全地得到想要的實驗數據。 CFSE/PI標記細胞后通常用流式細胞儀進行細胞毒性檢測。 CFSE標記細胞呈綠色熒光，熒光波長：λex=496 nm,λem=516 nm。流式檢測時的激發波長可以選擇488nm，此時的發射波長為516nm，使用流式細胞儀檢測時可以采用FL1 detection channel。PI標記細胞呈紅色熒光，流式檢測時的激發波長可以選擇488nm，此時的發射波長為647nm，使用流式細胞儀檢測時可以采用FL2 detection channel。 CFSE標記的細胞除了流式細胞儀檢測細胞毒性外，還可單染后用于細胞增殖檢測，或者用熒光酶標板定量活細胞數目，或者用熒光顯微鏡進行均一染色的細胞示蹤觀察。 儲存條件：CFSE探針-20℃避光保存；溶解液-20℃保存；PI染色液2-8℃避光保存。 有效期：六個月。 |
細胞培養操作規程：
一．培養基及培養凍存條件準備：
1） 準備F-12K培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。
3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。
二． 細胞處理：
1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
細胞培養方法：
1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。
2、細胞復蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。
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操作規程
1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.
2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。
3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。
4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。
5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。
6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。
7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。
8、結果分析
a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100
b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)
