Anti-14-3-3 14-3-3 蛋白抗體單抗的標記目前動物用單抗，在動物疫病診斷和檢疫、妊娠檢測、性別鑒定等方面有廣泛的應用，大多以診斷試劑（盒）的形式提供，其中核心試劑為標記的單抗。下面將介紹zui常用的幾種標記技術。
（1） 酶標記A、 辣根過氧化物酶（HRP）標記辣根過氧化物酶（HRP）標記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應末了，用硼氫化鈉穩定Schiff氏堿。 Anti-14-3-3 14-3-3 蛋白抗體這里介紹兩種程序。
程序一：a. 將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時。
b. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。
c. 加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。
d. 稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下*玻璃棉的5ml注射器外筒內；隨后將上述交聯物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用（避光）3小時或4℃過夜。 Anti-14-3-3 14-3-3
e. 用少許PBS將交聯物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時（或4℃過夜）。
f. 將交聯物過Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）層析純化，分管收集*峰。g. 酶結合物質量鑒定：克分子比值測定酶量（mg/ml）=OD403×0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之間。酶結合率=酶量×體積/抗體，標記率一般為0.3-0.6，即1-2個HRP分子結合在一個抗體分子上，標記率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4時，E/P約為1。標記率=OD403/OD280酶活性和抗體活性的測定 可應用ELISA法、免疫擴散、DAB-H2O2顯色反應測定酶結合物的酶活性，抗體活性及效價、特異性。
h. HRP抗體結合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃存放，防止反復凍融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會影響酶活性。必要時凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護劑。
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程序二：1. 將5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無水乙醇溶液0.1ml，室溫攪拌作用1小時，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。
2. 再加1ml 0.06mol/L 過碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色；隨后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，輕攪1小時，中止氧化反應。
3. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過夜，更換三次緩沖液，注意避光。
4. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫輕攪2-3小時，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小時或過夜，或換用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小時。
5. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小時，更換三次緩沖液。
6. 用3000r/min離心30分鐘，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析三次，沉淀用少許PBS溶解，透析或層析除鹽，必要時進一步層析純化。7.8. 步驟同程序一。B、 堿性磷酸酶（AP）標記堿性磷酸酶（AP）用于標記抗體，常用戊二醛一步法，將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結合，制備成結合物。該法簡便，但所得產物不均一，抗體活性損失大，酶標記率低。其程序如下：1. 將5mg AP加入1ml抗體溶液（2mg/ml）中溶解，裝入透析袋，于4℃對0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時，換液三次。2. 加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時，4℃對PBS透析過夜，其間換液三次。3. 換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過夜，換液三次。4. 取出標記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標記物原液。5. 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存備用。C、 PAP、APAAP的制備PAP（過氧化物酶-抗過氧化物酶橋聯酶標技術）、APAAP（堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯酶標技術）的制備對于日益廣泛使用單抗的免疫細胞化學有重要意義。現在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應，只要配以相應的橋抗體，即可非常便利地應用單抗。因為PAP法和APAAP法不用任何化學交聯劑處理酶和抗體，它們的活性均不受化學因素的影響，提高了敏感性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得免疫沉淀物，再加入酶鹽水，過量的酶有助于免疫沉淀物的解離反應，調PH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAP。根據需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應橋抗體結合后，再與特定單抗組成完整的診斷試劑，這樣，單抗即可一步法用于診斷或檢測試驗等。 Anti-14-3-3 14-3-3
