人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA檢測試劑盒實驗原理 
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人高遷移率族蛋白 B1（HMGB-1）水平。用純化的人遷移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加高遷移率族蛋白 B1（HMGB-1），再與 HRP 標記的高遷移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗體結合形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的高遷移率族蛋白B（HMGB-1）呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算品中人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）濃度。 

試劑盒組成 

1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1瓶 

2 酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品（320µg/L） 0.5ml×1 瓶 

3 酶標包被板 12孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶 
4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1份 
5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2張 
6 顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1個 
標本要求 
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融 

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 

人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA檢測劑盒操作步驟 
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。 

160µg/L 5號標準品 150µl的原倍標準品加入150µl標準品稀釋液 
80µg/L 4號標準品 150µl的5號標準品加入150µl標準品稀釋液 
40µg/L 3號標準品 150µl的4號標準品加入150µl標準品稀釋液 
20µg/L 2號標準品 150µl的3號標準品加入150µl標準品稀釋液 
10µg/L 1號標準品 150µl的2號標準品加入150µl標準品稀釋液 
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl，然后再加待測樣品10µl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。 
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用 
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復5次，拍干。 

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50µl，空白孔除外。 
7. 溫育：操作同3。 
8. 洗滌：操作同5。 
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分

鐘. 
10. 終止：每孔加終止液50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。 

計算 
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 

人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA檢測試劑盒注意事項 
1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。 

2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。 
3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD 值大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。 

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 
6．底物請避光保存。 
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準. 
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 
9．本試劑不同批號組分不得混用。 
人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA檢測試劑盒保存條件及有效期 
1．試劑盒保存：；2-8℃。 
2．有效期：6個月