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實時熒光定量PCR（RT-PCR）實驗代測

1.聚合酶鏈反應（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），簡稱PCR。聚合酶鏈反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。Real -Time PCR，即實時監測PCR擴增產物并進行解析的方法，它是在PCR反應體系中加入熒光物質，并通過Real -Time PCR檢測系統對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時監測，zui終對實驗數據進行分析處理的方法。Real -Time PCR自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來，廣泛應用于生物研究的各個領域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探針法兩種。

實時熒光定量PCR（RT-PCR）實驗代測

2 方法

2.1 組織總RNA的提取

（1）取組織或者細胞于1mL的Trizol的勻漿管中，于勻漿機勻漿20sec，立即放于冰上；

（2）置于超凈臺中，溫育5min，12000r/min，離心10min；

（3）吸上清于新的1.5mL離心管中，加入200μL的氯仿，搖勻，室溫靜置2min，4℃，12000r/min，離心10min；

（4）吸取上清于新的1.5mL離心管中，加入600μL的異丙醇，混合均勻，室溫靜置15min，4℃，12000r/min，離心15min，棄上清；

（5）加入1mL75%的無水乙醇（750μL無水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀，4℃，12000r/min，離心5min，棄上清；

（6）加入1mL無水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，離心5min，棄上清，室溫干燥10min；

（7）加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存備用。

2.2 cDNA*條鏈的合成

2.2.1  總RNA中DNA的消除

37℃，30min；Hold，加1μL的EDTA；65℃，10min。

2.2.2 反轉錄

（1）按以下體系加入：

反應程序：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。

2.3 Real-time PCR擴增

將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下：

SYBRGreen Mix       12.5μL

上游引物F            0.5μL

下游引物R            0.5μL

ddH2O 9.5μL

cDNA模板 2μL

總體積 25μL

反應程序：

95℃ ，10min（95℃，15Sec；60℃，45Sec）×40；95℃,15 Sec； 60℃,1min；95℃,15 Sec；60℃, 15 Sec；

數據采用儀器自帶軟件分析:ABI Prism 7300 SDS Software

實驗結果

提供實驗原始數據

cytochrome c mRNA擴增動力學曲線

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