土壤中性磷酸酶(S-NP)試劑盒-微量法注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

土壤磷酸酶是催化土壤有機磷礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉化及其生物有效性，是評價土壤磷素生物轉化方向與強度的指標。磷酸酶活性受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH 的顯著影響，根據最適 PH 范圍，一般把土壤磷酸酶分為中性、酸性和堿性三種類型。

測定原理：

中性環境中，S-NP 催化磷酸苯二鈉水解生成苯/酚和磷酸氫/二鈉，通過測定酚的生成量即可計算出 NP 活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、臺式離心機、37℃恒溫培養箱、分析天平、可調式移液器、冰、蒸餾水、乙醇和甲苯。

土壤中性磷酸酶(S-NP)試劑盒-微量法試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。用前加 100mL 蒸餾水充分溶解。試劑三：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 576μL 無水乙醇（自備），24μL 蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）

標準品：液體×1 瓶，0.5 μmol/mL 酚標準液，4℃保存。

催化反應：

稱取風干混勻土壤約 0.1g，加入 50μL 甲苯（自備），輕搖 15min；加 400μL 試劑一并且搖勻后，置于 37℃恒溫培養箱，開始計時，催化反應 24h；到時后迅速加入 1mL 試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應。8000g，25℃離心 10min，取上清液置于冰上待測。

土壤中性磷酸酶(S-NP)試劑盒-微量法顯色反應：

1.分光光度計預熱 30 min 以上，調節波長到 660 nm，蒸餾水調零。

2.空白管：取微量玻璃比色皿/酶標板，加入 10μL 蒸餾水，20μL 試劑三，4μL 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 166μL，混勻后 25℃靜置 30min，于 660nm 測定吸光度，記為A 空白管。

3.標準管：取微量玻璃比色皿/酶標板，加入 10μL 標準液，20μL 試劑三，4μL 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 166μL，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660nm 測定吸光度，記為A 標準管。

4.測定管：取微量玻璃比色皿/酶標板，加入 10μL 上清液，20μL 試劑三，4μL 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 166μL，混勻后室溫 25℃30 min，于 660nm 測定吸光度，記為A 測定管。

注意：空白管和標準管只需測定一次。

S-NP 活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放 1nmol 酚為 1 個酶活單位。

S-NP（μmol/d/g  土樣）=[C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×V 總÷W÷T

= 0.725×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)÷W

C 標準液：0.5μmol/mL；V 總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質量，g；T：催化反應時間，24 h=1 d。土壤中性磷酸酶(S-NP)試劑盒-微量法