古朵生物：ELISA標準曲線繪制的注意事項

　　制作ELISA標準曲線是ELISA實驗中的重要步驟，很多人都不知道如何制作，其實標準曲線的制作很簡單，下面就跟隨古朵生物技術小編一起來看看ELISA標準曲線怎么制作吧!

　　在ELISA實驗結束后，我們得到的是經酶標儀得出的標準品以及樣本的OD值。其中，標準品的濃度已知，我們可以利用標準品的OD值及其相對應的濃度，以 OD值為橫坐標，濃度為縱坐標，做一條標準曲線，并用公式表示出來。這樣，我們把樣本的OD值以X值代入，便可求出Y值，即樣本濃度。

　　一、做標準曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意：

　　1、樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的，所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結果無從談起。

　　2、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內，包括上限和下限。而對于呈S型的標準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內。

　　3、最好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度，這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現較大的偏離。

　　4、檢測標準樣品時，應按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準確性。

　　5、標準曲線的樣品數一般為7個點，但至少要保證有5個點。

　　6、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動，但一般來說，相關系數R至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999.

　　二、選擇什么方程去擬合

　　用于免疫檢測的所謂“標準曲線"其實稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測時標準點(可以是倍比稀釋的，也可以不是)濃度如果和相應的吸光度(OD)值如果能夠呈現直線關系當然是理想的了，這時可以通過EXELL等獲得擬合曲線，進而推算出樣品的濃度值。但做免疫檢測很少能夠有這么理想的情況，標品濃度和相應OD值往往是“S"型的曲線關系，這時就不能用直線擬合的方式了，而對擬合方法進行選擇就是必要的了。

　　關于標準曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數、對數等雖都可用于ELISA及其它生物學反應中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的適用性。當然，如果用于定量，還是在中間一段較好。這些方法雖然沒有一種方法可以通用，但也都可以用。關鍵在于你的標準曲線做到了S形的哪一部分，你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃度部分可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部分可以用直線方程，中間部分可用對數方程，而中后段可用四參數。

　　目前國際上流行的免疫檢測擬合方式是“四參數邏輯擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關系，從而進一步比較正確的獲得樣品中待測物質的濃度值。

　　其實，在一個長的區間內，Logistic應該都能擬合得較為理想。但并不是說它就是萬能的。事實上不僅是ELISA，其它很多生物學反應都是S形曲線，也都可以用Logistic曲線擬合。但建模型是一回事，而用它來定量是另一回事。如果用來定量，S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的，而兩端的平坦部分計算誤差會大，有時甚至會很大。

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