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貨號	BJ-01X6355

中文名稱：Alexa Fluor 488/PI細胞凋亡檢測試劑盒

英文名稱：Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50次

產(chǎn)品貨號：BJ-01X6355

本試劑盒是一種采用Annexin V-Alexa Fluor 488與PI雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。

細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲(PS)從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶不能通過完整的活細胞，但能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募毎M行染色，因此通常將Annexin V與PI配合染色，以區(qū)別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞。

操作步驟：

1、細胞樣品的準備：

a．對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。

b．對于懸浮細胞：1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。

2、用去離子水按1:3稀釋Binding Buffer(4ml Binding Buffer +12ml 去離子水)。

3、用 250μl Binding Buffer重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/ml。

4、取 100μl的細胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-Alexa Fluor 488 和10μl 20μg/ml的PI溶液。

5、混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘。

6、在反應(yīng)管中加 400μl PBS，流式細胞儀(FACS)分析。

Annexin V-Alexa Fluor 488 PI雙染流式分析圖譜

Jurkat細胞用誘導(dǎo)凋亡后用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI雙染流式分析圖譜

儲存條件：2～8℃，避光保存

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細胞處理：

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

QQ截圖20220509112004.png

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

Avian Infectious Bronchitis Virus(AIBV)禽傳染性支氣管炎病毒Delaware型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Plasmodium spp.瘧原蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Radix astragali黃芪LAMP鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-4周

Giardia intestinalis腸賈第蟲LAMP試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Avian Leukosis Virus(ALV)禽白血病病毒E亞群RT-LAMP試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Thallus laminariae昆布PCR鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-4周

St.Louis Encephalitis Virus(SLEV)圣路易斯腦炎病毒RT-LAMP試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Pericarpium zanthoxyli花椒LAMP鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-4周

Fructus momordicae羅漢果PCR鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-4周

Ornithostrongylus quadriradiatus四輻射鳥圓線蟲LAMP試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Dermanyssus gallinae雞皮刺螨探針法熒光定量PCR試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Arcanobacterium haemolyticum溶血隱秘桿LAMP試劑盒動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負20度一年 2-3周

Alexa Fluor 488/PI細胞凋亡檢測試劑盒耦聯(lián)比色法定量檢測試劑盒

有機磷細菌培養(yǎng)基英文名稱：Bacterial organophosphorus Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g

細胞纖維蛋白溶原激活劑抑制物（PAI）活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒 20次

冰凍切片組織COLLAGEN II蛋白表達NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒 10/20次

血液超氧化物陰離子比色法定量檢測試劑盒 20次

支原體培養(yǎng)基英文名稱：Mycoplasma Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g

石蠟切片結(jié)締組織（CONNECTIVE TISSUE）格莫瑞（Gomori）染色試劑盒 50次

超白金TAG DNA聚合 200 U

石蠟切片磷脂尼羅紅（Nile Red）間接熒光染色試劑盒 10次

真/酵母a-淀粉（a-AMYLASE）活性CNPG3比色法定量檢測試劑盒 20次

SS瓊脂顆粒英文名稱：SS Agar 產(chǎn)品規(guī)格：300ml/袋*10

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)