1．ELISA固相載體的選擇 載體的種類很多，其中包括纖維素、交聯右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。從使用形式上可有凹孔平板、試管、珠粒等。
聚苯乙烯凹孔板是應用zui廣泛的一種載體。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作簡便、用量小，適于大批檢查。
由于聚苯乙烯的工藝過程不夠穩定,造成各批次差異較大。所以進行ELISA之前，必須進行篩選。檢查方法：
⑴ 吸附性能的檢查：先加抗體包被，然后加入同一稀釋度的酶標抗體，zui后加底物、顯色、測OD值,求出總平均OD值,再求出每相鄰兩孔的OD平均值,此均值在總均值的±10%以內為合格,若中間孔與四周孔OD值相差太大，或一側與另一側孔OD值相差較大均屬不合格。
⑵ 對比測定陽性血清與陰性血清，觀察是否存在明顯差異，若二者OD值相差于10倍以上者為合格。
板的處理。新板一般不用處理,用蒸餾水沖洗即可應用。板用一次即廢。但不少實驗工作者認為用超聲波處理，清潔液Tritonx100、20%乙二醇處理仍可應用。但發現空白對照顯色較深和陽性樣品顯色結果不理想時，應棄去不用。
2．載體的吸附條件 載體的吸附均為物理吸附。吸附的多少取決于PH值、溫度、蛋白濃度、離子強度以及吸附時間等。
較好的吸附條件是：離子強度為0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸鹽緩沖液，蛋白濃度為1μg/ml~100μg/ml，4℃過一夜或37℃3h。
3．酶標抗體使用濃度的確定 于聚苯乙烯板孔中加足夠量的抗體包被,溫育一定時間，沖洗、把酶標結合物倍比稀釋，每個稀釋度加2孔,溫育、沖洗、再加底物顯色、比色。以OD值為縱坐標,酶標結合物的稀釋度為橫坐標，制作曲線。找出OD值為1時，相對應的酶標抗體稀釋度為zui適酶標抗體稀釋度。
這個稀釋度是指在這種條件下的zui適稀釋度，換個條件就不是zui適的了。如1﹕400的酶標抗體稀釋度溫育6h可與1︰6 400稀釋度溫育24h結果相同。所以一旦條件確定之后，就不要變更，以保證結果的重復性和相對的準確性。
此zui適酶標抗體稀釋度可做為工作濃度，也可提高半個至一個滴度，但不能提高過高，否則非特異性顯色增加。
酶標抗體的滴度反映酶標抗體的質量，也可以此比較酶標結合物的優劣。有材料報道認為1︰320滴度為合格,1︰1 000以上更好。酶標抗體滴度越高，用于工作濃度的稀釋倍數就越大，敏感性就越高，非特異性反應就越低。
