D-水楊苷特殊培養(yǎng)法

二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序?yàn)椋?/span>

1.吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

2.用溫BSS沖洗1次。

3.用0.25%溫*消化，加入消化液量以僅覆蓋細(xì)胞層即可；作用1~5分鐘。

4.待細(xì)胞附著松動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細(xì)胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合）。

5.輕輕反復(fù)吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液。

6.按一分為二比例接種培養(yǎng)。

使用飼細(xì)胞(Feeder Cells)。制備方法：

1.取原代培養(yǎng)的人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，90%匯合時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按105細(xì)胞/毫升重新接種培養(yǎng)。

2.在細(xì)胞半?yún)R合時(shí)，準(zhǔn)備0.25μg/ml的絲裂霉素C，按2μg/106細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞。

3.細(xì)胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時(shí)，*消化細(xì)胞制成懸液，按5×104（104細(xì)胞/cm2）接種入新D-水楊苷中。

4.48小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。

D-水楊苷細(xì)胞分離（克隆）培養(yǎng)

多孔塑料培養(yǎng)板單細(xì)胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆細(xì)胞，吸出瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，加消化液。

2.低密度細(xì)胞懸液的制備：做克隆細(xì)胞時(shí)首先需先用消化法制備出分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后稀釋細(xì)胞，使之成為1~2細(xì)胞/毫升懸液，zui適宜細(xì)胞密度為1~2細(xì)胞/ml培養(yǎng)液。

3.接種：先用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5毫升。接種時(shí)要迅速準(zhǔn)確，爭(zhēng)取在zui短時(shí)間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)。

4.標(biāo)記：培養(yǎng)6~12小時(shí)后，待細(xì)胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺(tái)上，觀察和標(biāo)記下含有單個(gè)細(xì)胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無需換液，只有在細(xì)胞增長(zhǎng)過于緩慢時(shí)才可進(jìn)行換液。換液時(shí)先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過多，余少許，以免細(xì)胞干涸。然后再迅速補(bǔ)加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內(nèi)細(xì)胞增至500~600個(gè)時(shí)，可進(jìn)行分離培養(yǎng)。

5.分離擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)86~96小時(shí)后進(jìn)行觀察。挑選生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2次，繼加*少許，加入量已能覆蓋細(xì)胞群即可，如過多，應(yīng)吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓時(shí)，加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當(dāng)細(xì)胞離開底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補(bǔ)加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖，使之形成新的細(xì)胞群后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。

D-水楊苷相關(guān)產(chǎn)品如下：hz0259    人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞    IMR-32
hz0260    人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞    NCI-H661
hz0261    人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞    NCI-H446 [H446]
hz0262    人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞    NCI-H1299
hz0263    人胸膜瘤細(xì)胞    SMC-1
hz0264    人橫紋肌瘤細(xì)胞    A-673
hz0265    人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞    RD
hz0266    人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞    hFOB 1.19
hz0267    人骨肉瘤細(xì)胞    MG-63
hz0268    人骨肉瘤細(xì)胞    SW 1353
hz0269    人骨肉瘤細(xì)胞    U-2 OS
hz0270    人骨肉瘤細(xì)胞    MNNG/HOS Cl #5 [R-1059-D]
hz0271    人成骨肉瘤細(xì)胞    Saos-2
hz0272    人腎上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞    SW-13
hz0273    人腎上腺神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(腦轉(zhuǎn)移)    KP-N-NS
hz0274    人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤    U-87 MG
hz0275    人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞    SH-SY5Y
hz0276    人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞    SK-N-BE(2)
hz0277    人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞    SK-N-SH
hz0278    人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞    SK-N-MC
hz0279    人膠質(zhì)瘤細(xì)胞    SHG-44
hz0280    人膠質(zhì)瘤細(xì)胞    U251
hz0281    人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞    A172
hz0282    人惡性黑色素瘤細(xì)胞    A-375
hz0283    人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞    CCRF-CEM [CCRF CEM]
hz0284    人Ph+急淋白血病細(xì)胞系    SUP-B15
hz0285    人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞    U-937
hz0286    人B淋巴母細(xì)胞    HMy2.CIR
hz0287    人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞    NAMALWA
hz0288    人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞    Raji
hz0289    人EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞    CGM1