木糖發(fā)酵管特殊培養(yǎng)法

二倍體細胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關鍵在于傳代，其傳代程序為：

1.吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

2.用溫BSS沖洗1次。

3.用0.25%溫*消化，加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可；作用1~5分鐘。

4.待細胞附著松動、細胞質邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合）。

5.輕輕反復吹打制成單個細胞懸液。

6.按一分為二比例接種培養(yǎng)。

使用飼細胞(Feeder Cells)。制備方法：

1.取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細胞，90%匯合時制成細胞懸液，再按105細胞/毫升重新接種培養(yǎng)。

2.在細胞半?yún)R合時，準備0.25μg/ml的絲裂霉素C，按2μg/106細胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30～50戈瑞。

3.細胞經上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時，*消化細胞制成懸液，按5×104（104細胞/cm2）接種入新木糖發(fā)酵管中。

4.48小時后，即可用于細胞克隆之用。

細胞分離（克隆）培養(yǎng)

多孔塑料培養(yǎng)板單細胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆細胞，吸出瓶內培養(yǎng)液，加消化液。

2.低密度細胞懸液的制備：做克隆細胞時首先需先用消化法制備出分散成單個細胞懸液，然后稀釋細胞，使之成為1~2細胞/毫升懸液，zui適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養(yǎng)液。

3.接種：先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內加0.5毫升。接種時要迅速準確，爭取在zui短時間內加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)。

4.標記：培養(yǎng)6~12小時后，待細胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺上，觀察和標記下含有單個細胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無需換液，只有在細胞增長過于緩慢時才可進行換液。換液時先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過多，余少許，以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內細胞增至500~600個時，可進行分離培養(yǎng)。

5.分離擴大培養(yǎng)：培養(yǎng)86~96小時后進行觀察。挑選生長良好的單細胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2次，繼加*少許，加入量已能覆蓋細胞群即可，如過多，應吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細胞變圓時，加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當細胞離開底物懸浮后，一并吸入管內，移入另瓶或皿中，再補加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖，使之形成新的細胞群后，即轉用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。

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